RTL Reverse Transcriptase
RTL transkrîptaza berevajî a DNA-polîmerazek girêdayî şablonê RNA ye ku çalakiya exonuclease 3'→5' tune ye û çalakiya RNase H heye.Ev enzîm dikare RNA-yê wekî şablonek bikar bîne da ku zencîreyek temamker a ADN-yê sentez bike, ku dikare ji bo senteza cDNA-ya yekem were sepandin, nemaze ji bo RT-LAMP (zêdekirina îzotermîk a bi navbeynkar).Li gorî RTL transkrîptaza berevajî 1.0, hesas bi girîngî çêtir dibe, aramiya termal bihêztir e, û reaksiyonê li 65 ° C aramtir e.RTL transkriptaza berevajî (bê glycerol) dikare ji bo amadekirina amadekariyên lyophilized, reagentên RT-LAMP yên lyophilized hwd.
Unit Definition
Yek yekîneyek 1 nmol dTTP di nav 20 hûrdeman de di 50°C de 1 nmol dTTP di maddeya ku bi asîd-barînê de dibarîne bi karanîna poly(A)•oligo(dT)25 wekî şablon-primer vedihewîne.
Components
| Perçe | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Transcriptase Berevajî (Bê Glîserol) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL Buffer | 1,5 ml | 4×1,5 mL | 5×10 ml |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 ml | 2×1,5 mL | 3×10 ml |
Rewşa Storage
Veguheztin di bin 0°C de û di -25°C~-15°C de were hilanîn.
Kontrola Kalîteyê
- Çalakiya Bermayî yaEndonuclease:Reaksiyonek 50 μL ya ku tê de 1 μg λDNA û 15 yekîneyên RTL2.0 hene ku ji bo 16 demjimêran li 37 ℃ înkubakirî ne, heman şêwaza kontrolkirina neyînî bi elektroforeziya gel nîşan dide.
- Çalakiya Bermayî yaExonuclease:Reaksiyonek 50 μL ya ku tê de 1 μg Hind Ⅲ λDNA û 15 yekîneyên RTL2.0 ên ku 16 demjimêran li 37 ℃ inkubated hene, bi elektroforeziya gel re heman şêwaza kontrolkirina neyînî nîşan dide.
- Çalakiya Bermayî yaNickase:Reaksiyonek 50 μL ya ku di nav xwe de 1 μg pBR322 ya supercoiled û 15 yekîneyên RTL2.0-ê 4 demjimêran li 37 °C inkubated dike, heman şêweya kontrolkirina neyînî bi elektroforeziya gel re nîşan dide.
- Çalakiya Bermayî yaRNase:Reaksiyonek 10 μL ya ku tê de 0,48 μg MS2 RNA û 15 yekîneyên RTL2.0 hene ku ji bo 4 demjimêran li 37 °C têne înkub kirin, heman şêwaza kontrolkirina neyînî bi elektroforeziya gel nîşan dide.
- E. coli gDNA:Pîvan biE.coliKîteyên tespîtkirina HCD-ê yên taybetî, 15 yekîneyên RTL2.0 ji 1 kêmtir heneE. coligenom.
Setup Reaksiyonê
Protokola Senteza cDNA
| Components | Bend |
| Şablon ARN a | bixwe |
| Oligo(dT) 18~25(50mM) an Tevlihevkirina Destpêka Tesadufî(60mM) | 2 μL |
| dNTP Mix (her 10mM) | 1 μL |
| Inhibitorê RNase (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL Buffer | 2 μL |
| Ava bê nukleaz | Heta 20 μL |
Têbînî:
1) Doza pêşniyarkirî ya RNA-ya tevahî 1ng~1μg e
2) Doza pêşniyarkirî ya mRNA 50ng~100ng bû
Thermo-bisiklêtan Mercên ji bo rûtîn bersivî:
| Germahiya (°C) | Dem |
| 25 °Ca | 5 min |
| 55 °C | 10 minb |
| 80 °C | 10 min |
Têbînî:
1) Heke Random Primer Mix were bikar anîn, gavek inkubasyonê li 25°C.
2) Ger tevliheviya pêşîn a armanc tê bikar anîn, gavek inkubasyonê li 55 ° C ji bo 10 ~ 30 hûrdem.
Protokola RT-LAMP
| Components | Bend | Koncentrasyona dawî |
| Şablon RNA | bixwe | ≥10 kopî |
| dNTP Mix (10mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP Primers (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 Primers (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| Inhibitorê RNase (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reaction |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7.5 U / Reaksiyonê |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaksîyon |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 μL | 6 mM (Bi tevahî 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (an 10×HC Bst V2 Buffer) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Ava bê nukleaz | Heta 25 μL | - |
Têbînî:
1) Ji bo berhevkirinê bi dorhêlê tevlihev bikin û bi kurtî santrîfuj bikin.Germahiya domdar di 65 ° C de ji bo 1 saetê vebirin.
2) Her du tampon bi hev ve girêdayî ne û xwedan heman pêkhate ne.
Têbînî
1.Ev hilber dema ku di -20 °C de were hilanîn dê hişkek spî çêbike.Ji -20°C derxin û bi qasî 10 deqîqeyan bidin ser cemedê.Piştî helandinê, ew dikare bi hejandin û tevlihevkirinê were bikar anîn.
2. Hilbera cDNA dikare li -20°C an -80°C were hilanîn an jî tavilê ji bo reaksiyona PCR were bikar anîn.
3. Ji bo pêşîgirtina gemariya RNase, ji kerema xwe qada ceribandinê paqij bihêlin, û di dema xebatê de destmal û maskeyên paqij li xwe bikin.
