EndoFree Plasmid Maxi Kit
Ev kît ji bo derxistina 150 - 300 ml çareseriya bakterî ya ku di şevekê de hatî çandin, bi karanîna rêbazek lîza SDS-alkalîn a çêtirkirî ji bo lîzkirina bakteriyan minasib e.Ekstrakta xav bi bijartî bi Endotoksîn Scavengerek yekta re tê hev kirin û ji hêla santrîfugê ve tê veqetandin da ku endotoksîn jê bibe.Dûv re, membrana silicagel bi bijartî bi DNA-ya plasmîdê re di çareseriyê de di bin şert û mercên xwê yên bilind û pH-ya kêm de girêdide.Piştî vê yekê tampona şuştinê tê zêdekirin da ku nepaqijî û pêkhateyên bakterî yên din ji holê rake.Di dawiyê de, tamponek helandinê ya kêm-xwê, bi pH-ya bilind tê bikar anîn da ku DNA-ya plasmîdê ya paqij ji parzûna matrixê ya silicon derxîne.Membrana silica gel membrana adsorpsiyonê ya taybetî bikar tîne, û cûdahiya mîqdara adsorpsiyonê di navbera stûn û stûnê de pir piçûk e û dubarebûn baş e.Fenol, kloroform û reagentên jehrî yên din ne hewce ne, û ne jî gavên barîna etanolê hewce ne.Ev kit dikare were bikar anîn da ku bi lez 0,2 -1,5 mg ADN-ya plasmîdê ya paqij a kopya bilind, bi rêjeya derxistina 80% -90% were derxistin.Kit formula pêvajoyek yekta bikar tîne ku endotoxin jê dike, naveroka endotoxin zehf kêm e û bandora veguheztina hucreyê pir xweş e.Plazmîda hatî derxistin dikare rasterast di vejandina enzîmê, PCR, veguheztina in vitro, veguherîn, rêzkirin û ceribandinên din ên biyolojiya molekulî de were bikar anîn.
Şertên hilanînê
RNaseA divê di -30 ~ -15 ℃ de were hilanîn û di ≤0℃ de were veguheztin.
Endotoxin Scavenger dikare mehekê li 2 ~ 8 ℃, ji bo hilanîna demdirêj li -30 ~ -15 ℃ were hilanîn.û di ≤0℃ de hate veguhestin.
Pêdivî ye ku pêkhateyên din li germahiya odeyê (15 ~ 25 ℃) werin hilanîn û li germahiya odeyê werin veguheztin.
Components
| Components | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| Tampon P1 | 75 ml |
| Tampon P2 | 75 ml |
| Tampon P4 | 75 ml |
| Endotoxin Scavenger | 25 ml |
| Tampon PW | 2 × 22 ml |
| Tampon TB | 20 ml |
| Stûnên Maxi DNA yên FastPure (Her yek di lûleya berhevkirina 50 ml de) | 10 |
| Tubeya Koleksiyonê ya bê Endotoksîn | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, ji bo rakirina RNA tê bikaranîn.
Tampon P1:tampon suspensionê ya bakterî, berî karanîna yekem RNaseA li Buffer P1 zêde bikin.
Tampon P2:tampon lîza bakterî (SDS/NaOH tê de ye).
Tampon P4:tampon bêbandorkirin.
Paqijkerê Endotoksîn:bi bandor endotoxin ji ekstrakta plasmîdê ya xav derdixe.
Buffer PW:tampon şuştin, berî karanîna yekem hêjmara diyarkirî ya etanolê lê zêde bikin.
Tampon TB:tampon elution.
Stûnên Maxi DNA FastPure:stûnên adsorption DNA plasmid.
Tubeyên berhevkirinê 50 ml:tubes berhevkirina filtrate.
Tubeya Koleksiyonê ya bê Endotoksîn:lûleyên berhevkirina DNA ya plasmîdê.
Materyalên Amadekirî
Etanol bêkêmasî, îsopropanol, 50 ml lûleyên santrîfujê yên dor-binî û 50 ml bê endotoksînlûleyên santrîfujê.
Applications
Ev hilber ji bo derxistina mezin a plasmîdên ji 150 - 300 ml çareseriya bakteriyan maqûl e.di şevekê de çand.
Pêvajoya Ceribandinê
1. 150 – 200 ml (ji 300 ml ne zêdetir) çareserîya bakterî ya ku di şevekê de hatî çandin hildin û li santrîfujê bikin.nêzîkî 11,000 rpm (12,000 × g) ji bo 1 - 2 min.Spernatantê bavêjin û bakteriyan berhev bikin.
Δ Dema ku ji 50 ml zêdetir çareseriya bakteriyan were berhev kirin, bakterî dikare bi lêzêdekirina çareseriya bakterî, santrîfugasyon, avêtina supernatant û gavên din ên di heman lûleya 50 ml de were berhev kirin.
gelek caran.
2. 7,5 ml Buffer P1 (ji kerema xwe kontrol bikin ka RNaseA li Buffer P1 hatiye zêdekirin) li santrîfujê zêde bikin.lûleya ku bakterî dihewîne û bi dorpêk an pîpîtkirinê bi tevahî tevlihev bike.
Δ Di vê gavê de ji nû ve vehewandina bakteriyan ji bo hilberînê krîtîk e, û divê piştî ji nû ve vegirtinê ti girûpên bakterî nebin.Ger kulîlkên bakterî hebin ku bi tevahî neyên tevlihev kirin, ew ê bandorê li lîzê bike, di encamê de berberî û paqijî kêm dibe.Ger OD600 ya çareseriya bakteriyan 0,65 be, tê pêşniyar kirin ku dema ku ji 150 ml çareseriya bakteriyan were derxistin 7,5 ml Buffer P1 were bikar anîn;Dema ku OD600 0,75 be, divê 8 ml tampon P1 were bikar anîn û cildên tamponên P2 û P4 li gorî wê bêne guheztin.Ger qebareya çareseriya bakteriyan heya 200 ml were zêdekirin, tê pêşniyar kirin ku ew were bikar anînqebareya tamponên P1, P2, û P4 bi rêjeyî zêde bibe.
3. Ji qonaxa 2. 7,5 ml tampon P2 li suspensiona bakteriyan zêde bikin û 6-8 bi nermî ser û jêr tevlihev bikin.car caran û li germahiya odeyê ji bo 4 - 5 deqeyan înkuba bikin.
Δ Bi nermî bizivirin da ku bi tevahî tevlihev bikin.Vortexing dê bibe sedema perçebûna ADN-ya genomîk, di encamê de perçeyên DNA-ya genomîk di plasmîdê de hatî derxistin.Di vê demê de, çareserî zirav û zelal dibe, ku nîşan dide ku bakterî bi tevahî lîz bûne.Demjimêr divê ji 5 hûrdeman derbas nebe da ku plasmîd ji hilweşandinê dûr nekevin.Ger çareserî ne zelal be, dibe ku di encamê de gelek bakterî hebinlîza netemam, ji ber vê yekê divê mîqdara bakteriyan bi rêkûpêk were kêm kirin.
4. Ji gava 3. de 7,5 ml tampon P4 li suspensiona bakteriyan zêde bikin û tavilê 6-8 caran bi nermî bizivirînin da ku çareserî bi tevahî tampon P2 bêbandor bike.Di vê demê de, pêdivî ye ku tîrêjên spî yên flocculent xuya bibin.Ji bo 10 - 15 hûrdeman bi zêdeyî 11,000 rpm (12,000 × g) santrîfuj bikin, bi baldarî lûleya santrîfujê ya 50 ml-ya dor-binê ya nû (jixwe amadekirî) bipippetînin û dûr bixin.barîna spî ya herikîn aspirate bikin.
Δ Buffer P4 zêde bikin û tavilê bizivirînin da ku baş tevbigerin.Bila boriyê bisekine heya ku barîna spî bi rengek wekhev li çaraliyê belav bibe da ku pêşî li hilberîna barîna herêmî ya ku dikare bandorê li bêbandorkirinê bike bigire.Heke berî santrîfûjasyonê barîna flokûlentê ya spî ya yekreng tune be û piştî santrîfujasyonê spernatant zelal nebe, lûle dikare wereji bo 5 hûrdeman din santrîfuj kirin.
5. Ji qonaxa 4. 0. 1 qatê hejmûnê (10% ê qebareya supernatantê, bi qasî 2,2 ml) Endotoxin Scavenger li supernatantê zêde bikin û bizivirînin tevlihevkirinê.Çareseriyê 5 hûrdeman têxin nav hemamek qeşayê an têxin nav qeşa pelçiqandî (an cemidana sarincokê) heya ku çareserî ji gewr bibe zelal û zelal (an jî hînhinekî gewr), û carinan çend caran tevlihev bikin.
Δ Piştî ku Endotoxin Scavenger li supernatantê were zêdekirin, dê supernatant gewr bibe lêpiştî ku di hemama cemedê de sar bibe, divê supernatant zelal bibe (an hinekî gewr).
6. Piştî ku supernatant 10 - 15 hûrdeman li germahiya odeyê (> 25 ℃) tê danîn, ew ê wekî gewr bibe.germahiya wê heta germahiya odeyê zêde dibe.Dûv re divê supernatant were berevajî kirin da ku tevlihev bibe.
Δ Ger germahiya odeyê kêmtir be an hûn dixwazin dema derxistinê kêm bikin, supernatant dikare 5 - 10 hûrdem di hemamek avê ya 37 ~ 42 ℃ de were înkubakirin û gava din dikare piştî supernatant were kirin.gewr dibe.
7. Li ser germahiya odeyê 10 hûrdeman li dora 11,000 rpm (12,000 × g) bi qasî 11,000 rpm (12,000 × g) santrîfuj bikin (germahiya divê >25℃ be) da ku qonaxê ji hev veqetînin.Qonaxa avî ya jorîn ADN-ê dihewîne dema ku qata qonaxa rûnê şîn a jêrîn endotoxin û nepakiyên din dihewîne.VeguheztinQonaxa avî ya ADNyê dihewîne lûleyek nû ûqatê rûn biavêjin.
Δ Germahiya di dema santrîfujasyonê de divê ji 25℃ zêdetir be ji ber ku veqetandina qonaxa bi bandor nabeheke germahî pir kêm be çêdibe.
Δ Ger veqetandina qonaxê ne bandor be, germahiya santrîfugê dikare li 30℃ were guheztin ûdema santrîfujasyonê dikare heya 15 hûrdeman zêde bibe.
Δ Tebeqeya rûn a şîn nemijê ji ber ku ew endotoksîn û nepakiyên din dihewîne.
Mekanîk
Resuspension Lysis Neutralization
◇ 7,5 ml Buffer P1 zêde bikin
◇ 7,5 ml Buffer P2 zêde bikin
◇ 7,5 ml Buffer P4 zêde bikin
Rakirina endotoxin
◇ 0. 1 qat ji qebareya supernatant Endotoxin Scavenger zêde bikin
Girêdan û şuştin
◇ 0,5 qatê qebareya îsopropanolê zêde bikin
◇ 10 ml Buffer PW zêde bikin
◇ 10 ml Buffer PW zêde bikin
Elution
◇ 1 - 2 ml Tampon TB an ddH2O bê Endotoksîn zêde bikin
