5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Hejmara pisîkê: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) tevliheviyek li ser bingeha sondajê ya yek-borî ye ku ji bo veguheztina berevajî ya yek-gavekî û PCR-ya mîqdar (qRT-PCR) guncan e.Ew piştgirî dide pêş-tevlihevkirina aşîkar û sondayan û piştî hilanîna demek dirêj li germahiya nizm aram dimîne.Nimûneya ku were ceribandin dema ku were bikar anîn, bêyî operasyona vekirina boriyê/pipekirinê ya zêde dikare rasterast were zêdekirin.Ev hilber hêmanan peyda dike, mînakî DNA-polîmeraza germ-destpêk, M-MLV, uracil DNA glycosylase (TS-UNG), RNase Inhibitor, MgCl.2, dNTP (bi dUTP li şûna dTTP), û stabîlker.Bi zêdekirina bilez a genetîkî ya guhezbar transkrîptaza berevajî û ADN polymerase, gengaz e ku di nav 20-40 hûrdeman de zêdekirina PCR were temam kirin.Ev reagent tamponek taybetî ya ji bo qPCR bi enzîmên tevlihev ên enzîma zêdekirina antî-bergirker û enzîma UNG bikar tîne.Ji ber vê yekê, ew dikare zêdebûnek baş a genên armanc bigire û pêşî li zêdekirina derewîn a ku ji ber qirêjiya bermayî û aerosolê PCR-ê ve hatî çêkirin bigire.Ev reagent bi piraniya amûrên PCR-ya mîqdar ên fluoresansê yên ji hilberînerên wekî Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad û Roche re hevaheng e.
Perçe
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Şertên Storage
Pêdivî ye ku hemî pêkhate ji bo hilanîna demdirêj -20 ℃ û heya 3 mehan di 4 ℃ de bêne girtin.Ji kerema xwe piştî şilbûnê bi tevahî tevlihev bikin û berî ku bikar bînin santrîfuj bikin.Gelek caran ji cemidan-germkirinê dûr bisekinin.
Amadekirina Pergala Reaksiyonê ya qRT-PCR
| Components | 25μLSîstem | 50μLSîstem | Koncentrasyona dawî |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 μL | 10 μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1 μL | 2 μL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mixa | 1 μL | 2 μL | 1× |
| Şablon RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Heta 25 μL | Heta 50 μL | – |
1) a. Giraniya paşîn a primer bi gelemperî 0.2 μM e.Ji bo encamên çêtir, berhevoka primer dikare di nav rêza 0.2-1μM de were xweş kirin.Bi gelemperî, hûrbûna sondajê dikare di nav rêza 0.1-0.3μM de xweşbîn bibe.
2) b. Dema ku Pêvajoyek PCR-ya bilez tê bikar anîn, zêdekirina giraniya primer û sondajan dibe ku encamên baştirkirina amplifikasyonê encam bide, û divê rêjeya wan li gorî wê were xweş kirin.
3) Cûreyên cûrbecûr nimûneyên cûrbecûr û naveroka inhibitor û hejmara kopî ya genê armanc hene.Pêdivî ye ku hêjeya nimûneyê li gorî rewşa rastîn were hesibandin.Ger hewce be, nimûneyê bi ava bê nukleaz an jî TE Tamponê vekin.
Reaksiyona Conditions
| Pêvajoya PCR ya birêkûpêk | Pêvajoya PCR ya Zû | ||||||
| Doz | Temp. | Dem | Zîvirok | Doz | Temp. | Dem | Zîvirok |
| Reverse Transcription | 50℃ | 10-20 min | 1 | Reverse Transcription | 50℃ | 5 min | 1 |
| Polymerase Activation | 95℃ | 1-5 min | 1 | Polymerase Activation | 95℃ | 30s | 1 |
| Denaturasyon | 95℃ | 10-20s | 40-50 | Denaturasyon | 95℃ | 1-3s | 40-50 |
| Annealing û Dirêjkirinî | 56-64℃ | 20-60 | Annealing û Dirêjkirinî | 56-64℃ | 3-20s | ||
Kontrola Kalîteyê
1.Tespîtkirina fonksiyonê: hestiyar, taybetmendî û dubarebûna qPCR.
2.Çalakiya nukleazê ya biyanî tune: endonuclease û qirêjiya exonuclease tune.
Têbînî
1.Rêjeya zêdekirina DNA polymerase ya bilez ji 1kb/10s ne kêmtir e.Amûrên PCR-ê yên cihêreng xwedan leza germkirin û sarbûnê, awayên kontrolkirina germahiyê û veguheztina germî ne, û bi vî rengî xweşbînkirina berhevdana primer / sondaya we û rêbaza xebitandinê digel amûra weya PCR-ya bilez a taybetî re girîng e.
2.Ev hilber serîlêdana berfireh pêk tîne, û ew ji bo teşhîsa molekular-hesasiya bilind maqûl e.Rêbaza PCR-ya sê-gavekî ji bo primerên bi germahîya pijandinê kêm an ji bo zêdekirina perçeyên dirêj ên ji 200 bp ve tê pêşniyar kirin.
3.Ji ber ku amplikonên cihêreng xwedan karbidestiya karanîna cûda ya dUTP û hesasiyeta cûda ya UNG-ê ne, ger dema ku pergala UNG bikar tînin hesasiyeta tespîtê kêm bibe divê reagent werin xweşbîn kirin.Ger hewce be ji kerema xwe ji bo piştgiriya teknîkî bi me re têkilî daynin.
4.Ji bo nehiştina zêdekirina hilberên PCR-ya hilgirtinê, ji bo zêdekirinê qada ceribandinê û pipettek taybetî hewce ne.Bi destmalan bixebitin û pir caran biguhezînin û lûleya PCR piştî zêdekirinê venekin.
