Uracil DNA Glycosylase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG an UDG) klonek vejenê ya E.coli ye ku giraniya wê ya molekulê 25 kDa ye.Ew serbestberdana uracila belaş ji ADNya yek-zindî û du-zindî ya ku uracil vedihewîne katalîz dike, û li hember RNA neçalak e, û dikare were bikar anîn da ku pêşî li gemarkirina hilberên zêdekirina PCR bigire.Prensîba çalakiyê li ser vê rastiyê ye ku heke di reaksiyona PCR-ê de dUTP şûna dTTP-ê bigire û hilberek zêdekirina PCR-yê ku bazên dU-yê vedihewîne çêbibe, enzîm dikare bi bijartî girêdana glycosîdîk a bazên U-ya yek-zindî û du-zindî bişkîne. DNA û hilbera zêdekirina PCR hilweşîne.
Serlêdana Pêşniyar kirin
Pêşîlêgirtina Contamination Amplification
Rewşa Storage
-20°C ji bo depokirina demdirêj, divê berî ku were bikar anîn baş were tevlihev kirin, ji cemidandin-germbûna pir caran dûr bisekinin.
Storage tampon
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilîzator, %50 Glîserol.
Unit Definition
Mîqdara enzîma ku ji bo hilweşandina 1 μg ADN-ya yek-zindî ya ku bazên dU di 1 saetê de di 37°C de hewce dike, 1 yekîne ye.
Kontrola Kalîteyê
1.SDS-PAGE paqijiya elektroforetîkî ji% 98 mezintir
2.Hestiyariya zêdekirinê, kontrolkirina hevîrê, aramî
3.Piştî ku 1U UNG ji bo 2 hûrdeman di 50 ℃ de were derman kirin, divê şablona ku U di binê 103 kopiyan de heye bi tevahî were hilweşandin û hilberek amplîfasyonê neyê hilberandin.
4.Çalakiya nukleazê ya exogenous tune
Instructions
| Components | Volume (μL) | Teqandina dawî |
| 10 × PCR Tampon (dNTP belaş, Mg²+belaş) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (li şûna dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Têkelkirina Primeryek | 2 | 1× |
| Şablon | - | ＜1 μg/reaksiyon |
| ddH2O | Heta 50 | - |
Not: a: Ger ji bo qPCR/qRT-PCR were bikar anîn, divê sondaya fluorescentê li pergala reaksiyonê were zêdekirin.Bi gelemperî, giraniya yekem a paşîn a 0.2 μM dikare encamên baş bide;dema ku performansa reaksiyonê xizan be, hûrbûna primer dikare di navbera 0,2-1 μM de were sererast kirin.Bi gelemperî, hûrbûna sondajê di navbera 0.1-0.3 μM de xweşbîn e.Ezmûnên gradientê yên konsantasyonê dikarin bêne kirin da ku hevrêziya çêtirîn a primer û sondajê bibînin.
Têbînî
1.Enzîma UNG dikare were bikar anîn da ku hilberên zêdekirina dUTP-a qirêj ji pergala reaksiyonê berî reaksiyona zêdekirina PCR-ê derxîne, dûv re ji ber gemariya hilberê ji encamên erênî yên derewîn dûr bixe.
2.Germahiya çêtirîn ji bo enzîma UNG ya ku di reaksiyona PCR-ya dijî-tevlîbûnê de tê bikar anîn bi gelemperî 50 ℃ ji bo 2 hûrdeman e;rewşa neçalakkirinê 95 ℃ ji bo 5 hûrdeman e.
3.Pir caran ji cemidan-germbûnê dûr bikevin, û li ber guheztinên mezin ên germahiyê nehêlin.
4.Genên cihêreng ên ku werin zêdekirin xwedan karbidestiya karanîna cûda ya dUTP û hestiyariya enzîma UNG-ê ne, ji ber vê yekê, heke karanîna pergala UNG bibe sedema kêmbûna hesasiya tespîtê, divê pergala reaksiyonê were sererast kirin û xweşbîn kirin, ger hewcedariya we bi piştgiriya teknîkî hebe, ji kerema xwe têkilî daynin. şîrketa me.
