Plant direct PCR Kit
Hejmara pisîkê: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit ji bo zêdekirina rasterast a pelên nebatan, tov û hwd., maqûl e, û dikare ji bo vekolîna berbelavbûna nimûneyên nebatan ên ku polysaccharîd û polîfenolan nagirin were bikar anîn.Amplification DNA polymerase ya rasterast a ku li ser bingeha pêşkeftina rêvekirî ye, xwedan toleransek bilindtir e li hember înhîbîtorên PCR di nebatan de.Di vê navberê de, ew performansa zêdekirina bilind diparêze, ku ji bo zêdekirina perçeyên DNA di nav 5 kb de maqûl e.Tampona Lysis A ya bêhempa ya di kîtê de dikare ji bo lîzkirina tevnên nebatê yên nû an cemidî were bikar anîn.Ew xebitandin hêsan e û lysate dikare wekî şablonek ji bo zêdekirina bêyî paqijkirinê were bikar anîn.Pergal dihewîne ajansên parastinê yên ku dihêle ku nimûneyên xav bi bandorkerî piştî cemidandin û şilbûna dubare werin zêdekirin.2 × Plant Direct Master Mix tenê pêdivî ye ku primer û şablonan lê zêde bike da ku reaksiyona amplifikasyonê pêk bîne, bi vî rengî operasyonên pîpkirinê kêm bike û rêjeya tespîtê û dubarebûna encaman baştir bike.
Components
| Components | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direct Master Mix | 1,25 ml | 4×1,25 ml |
| Tampona Lysis Direct Plan A | 5 ml | 20 ml |
| Plant Direct Lysis Buffer B* | 5 ml | 20 ml |
* Plant Direct Lysis Buffer B reagentek vebijarkî ye, ku ji bo bêbandorkirina Plant Direct Lysis Buffer A ji bo dirêjkirina dema hilanîna nimûneyan tê bikar anîn.Li gorî rewşa rastîn dikare were bikar anîn.
Şertên Storage
2 × Miksa Direct Master Plant, li -30 ~ -15 ℃ hilînin û ji cemidandin û şilbûna dubare dûr bigirin;Tamponek rasterast a Lysisê biçînin, li -30 ~ -15 ℃ an 2 ~ 8 ℃ hilînin.
Pêvajoya Ceribandinê
Sample Processing–Plant Leaf
Rêbaza rasterast:Tê pêşniyar kirin ku pelên ciwan bikar bînin.Ji bo bidestxistina nimûneyek piçûk û yekreng, qulikek bi dirêjahiya sabît 0,5 - 3 mm bikar bînin, û dûv re rasterast nimûneyê li pergala PCR zêde bikin (pergala 50 μl tê pêşniyar kirin).Nîşe, pê ewle bin ku nimûne di çareseriya PCR de ye û ne li hember dîwarê boriyê ye.Ger PCR rasterast ji bo zêdekirina perçeyên dirêj û nimûneyên tevlihev were bikar anîn, karanîna nimûneyek bi pîvanek piçûktir (0,5 - 1 mm) wekî şablon dikare ji bo bidestxistina encamên çêtir bibe alîkar.
Rêbaza lîzê ya qirkirinê:Tê pêşniyar kirin ku pelên ciwan bikar bînin.Parçeyek pelê piçûk hildin (bi dirêjahiya 1-3 mm), wê têxin nav 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, û bi qasî ku pêkan e hûr bikin (ev gav dikare bi pelçiqandina pelê bi 100 μl lûleya pipetê were kirin. nimûneyê mash bike).Ger cildên mezin ên tevna pelan werin bikar anîn (ji 7 mm derbas neke), hêjahiya tamponê dirijîne heya 50 μl.Piştî ku pel têne zev kirin, çareserî divê kesk xuya bibe.Piştî santrîfujasyonek kurt, 1 μl supernatant wekî şablonek reaksiyonê li pergala PCR zêde bikin.
Rêbaza lîza termal:Tê pêşniyar kirin ku pelên ciwan bikar bînin.Parçeyek pelê ya piçûk hildin (bi dirêjahiya 1-3 mm), wê têxin nav 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, û li 95°C ji bo 5-10 hûrdeman germ bikin.Demjimêra lîzê dikare ji bo pelên ku lêdana wan dijwar e bi guncan were dirêj kirin (ji 20 hûrdeman bêtir).Ger cildên mezin ên tevna pelan têne bikar anîn (ji 7 mm derbas neke), hêjahiya tamponê dirijîne heya 50 μl.Piştî germkirinê, bi kurtî santrîfuj bikin, û 1 μl supernatant li pergala PCR-ê wekî şablonek reaksiyonê zêde bikin.
Sample Processing- Tov biçînin
Rêbaza lîzê ya qirkirinê:Scalpelê bikar bînin da ku tovên bi dirêjahiya 5 mm jê bikin, wan li 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A zêde bikin, û nimûneyê bi tîpek pîpetê an amûrên din hûr bikin.Bi kurtî bizivirin û 3-5 hûrdeman li germahiya odeyê bihêlin.Piştrast bikin ku nimûneya tovê di nav tamponê helandinê de ye.Piştî santrîfûjasyonek kurt, 1 μl supernatant wekî şablonek reaksiyonê li pergala PCR zêde bikin.
Rêbaza lîza termal:Scalpelê bikar bînin da ku tovên bi dirêjahiya 5 mm jê bikin, wan bixin nav 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, û 5 - 10 hûrdem li 95°C germ bikin.Demjimêra lîzê dikare ji bo pelên ku lêdana wan dijwar e bi guncan were dirêj kirin (ji 30 hûrdeman bêtir).Piştî germkirinê, bi kurtî santrîfuj bikin, û 1 μl supernatant li pergala PCR wekî şablonek reaksiyonê zêde bikin.
yek.Ji bo qutkirina nimûneyên bi qebareya guncaw jî dikarin meqes an amûrên din jî bikar bînin;ger kulmek an maqeş ji nû ve were bikar anîn, divê berî her karanîna bi 2% çareseriya hîpoklorît sodyûm were paqij kirin da ku pêşî li gemarîbûna di navbera nimûneyan de bigire.
b.Pê bawer bin ku Plant Direct Lysis Buffer berî ku were bikar anîn bi tevahî heliyaye.Ger tampon zirav be an barhilgir hebe, ew dikare di 37℃ de were germ kirin da ku berî karanîna bi tevahî bihele.
c.Hêjmara şablonê di pergala reaksiyonê de li gorî ciyawaziya hêjahiya materyalê nebatê û diluentê lê zêdekirî de bi rêkûpêk dikare were sererast kirin.
Plant Direct Lysis Buffer
Plant Direct Lysis Buffer A ya ku di vê hilberê de heye, bi hişkî xweştir bûye da ku genoma piraniya tevnên nebatan azad bike û ji bo hilanîna nebatên xav di 4℃-ê de maqûl e.Ger pêdivî ye ku nimûne ji bo demek dirêjtir were hilanîn (mînak, 1-2 meh), tê pêşniyar kirin ku supernatant veguhezînin boriyek nû ya EP-ê û li -20℃ hilînin.Ji bo ku nimûneyan bi îstîqrartir hilînin, hêjmarek wekhev a Plant Direct Lysis Buffer B li supernatantê veguhestî zêde bikin, baş tevlihev bikin û di -20℃ de hilînin.Dema hilanînê ya domdar bi nimûneyên nebat û rewşan diguhere.
Pergala Reaksiyonê
| ddH2O | Heta 20,0 μl | Heta 50,0 μl |
| 2 × Plant Direct Master Mixa | 10,0 μl | 25,0 μ |
| Primer 1 (10 μM) | 0,8 μl | 2,0 μl |
| Primer 2 (10 μM)b | 0,8 μl | 2,0 μl |
| Nimûneya pelê nebatê / jêgirtina xav(Binêre Pêvajoya Nimûne) | Dîska pelê 0,5 – 3 mm/x µl | Dîska pelê 0,5 – 3 mm/x µl |
yek.Mg heye2+bi giraniya dawî ya 2 mM.
b.Tête pêşniyar kirin ku ji bo her primerê 0.4μM ya dawîn bikar bînin.Bikaranîna zêde ya primeran dê bibe sedema zêdebûna zêdekirina netaybetî.
c.Mîqdara nimûneya ku tê bikar anîn dikare li gorî rewşa rastîn were sererast kirin.Mîqdara ku di yek reaksiyonê ya nimûneya lîzkirî ya xav de tê bikar anîn dikare di navbera 2% - 20% ji qebareya giştî ya reaksiyonê de were sererast kirin.Bikaranîna pir nimûneyan dikare bibe sedema têkçûna amplification.
Bernameya Reaksiyonê
| Steps | Germî | Dem |
| Denaturasyona Destpêkê | 98℃ | 5 min |
| Denaturasyon | 95℃ | 10 sec |
| Annealing | 58 ~ 72 ℃ | 15 sec |
| Dirêjkirinî | 72℃ | 30 sec |
| Berfirehkirina Dawî | 72℃ | 5 min |
yek.Denaturasyona Destpêkê (98℃, 5 hûrdem) lîza tevna nebatê pêşve dike, DNAya genomîk ku dikare ji bo zêdekirina PCR were bikar anîn azad dike.Dem kurt nekin û germahiyê kêm nekin.
b.Tête pêşniyar kirin ku ew bi nirxa Tm a pêşîn an jî 2 ~ 4 ℃ ji nirxa Tm mezintir were danîn.Polîmeraza DNA ya rasterê ya ku di vê hilberê de tê bikar anîn ji Taq DNA polîmeraza kevneşopî cûda ye, û ji bo germahiya vejandina reaksiyonê hewcedariyên taybetî hene.Ji bo şablonên tevlihev, zêdekirina bikêrhatî dikare bi verastkirina germahiya annealkirinê û dirêjkirina dema dirêjkirinê were bidestxistin.
c.Heke dirêjahiya hilbera zêdekirinê ≤1 kb be, dema dirêjkirinê li 30 sec/kb tê danîn;heke dirêjahiya hilbera zêdekirinê > 1 kb be, dema dirêjkirinê li 60 sec/kb tê danîn.
d.Ji bo nimûneyên tevlihev an nimûneyên bi hilberîna amplification kêm, jimara dorpêkan dikare bi guncan bigihîje 40 -50 dewreyan.
Applications
Ew ji bo zêdekirina rasterast a tevnên nebatan û vekolîna berbelavbûna nimûneyên nebatan ên ku polysaccharîd û polîfenolan nagirin, tê sepandin.
Têbînî
Tenê ji bo lêkolînê bikar bînin.Ne ji bo karanîna di prosedurên tespîtkirinê de ye.
1. Ji bo zêdekirina nebatê ya xav an zêdekirina rasterast, tê pêşniyar kirin ku berî destpêkirina ceribandinê DNA-ya genomîk a paqijkirî wekî kontrolek erênî bikar bînin da ku pê ewle bibin ku pergal, destpêk û xebitandin rast in.
2. Polîmeraza DNA ya rasterê ya ku di vê kîtê de tê bikar anîn xwedan çalakiyek rastnivîsandina bihêz e.Ger hewce bike ku klonkirina TA were kirin, tê pêşniyar kirin ku berî ku adenîn lê zêde bike DNA were paqij kirin.
3. Rêbernameya Design Primer：
yek.Tête pêşniyar kirin ku bingeha paşîn a li dawiya 3 'ya primerê G an C be.
b.Divê di 8 bazên paşîn de di dawiya 3 'dawiya primerê de ji hevûdu nelihevkirinên bête dûr kirin.c.Ji strukturên porê porê li dawiya 3'ya primerê dûr bixin.
d.Cûdahî di nirxa Tm ya aşîkara pêş û ya berevajî de divê ji 1℃ zêdetir nebe û nirxa Tm divê li 60 ~ 72 ℃ were guheztin (Primer Premier 5 ji bo hesabkirina nirxa Tm tê pêşniyar kirin).
e.Dema ku nirxa Tm a primer tê hesabkirin divê rêzikên pêvek ên pêşîn ên ku bi şablonê re neyên berhev kirin tevnegerin.
f.Tê pêşnîyar kirin ku naveroka GC ya primer 40% -60% be.
g.Divê belavkirina giştî ya A, G, C û T di primerê de bi qasî ku gengaz be.Ji karanîna herêmên bi naveroka GC an AT-ya bilind dûr bisekinin.
h.Ji hebûna rêzikên temamker ên 5 an jî zêdetir bazan ne di nav primerê de an jî di navbera du destpêkeran de û ji hebûna rêzikên temamker ên 3 an jî zêdetir bingehan li dawiya 3'ya du primera xwe dûr bixin.
ez.Fonksiyona NCBI BLAST bikar bînin da ku taybetmendiya primerê kontrol bikin da ku pêşî li zêdekirina netaybetî bigirin.
