![M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase HC2004A Wêneyê Taybetmendî](https://cdn.globalso.com/hyasen/G64A5038-HC2004A.jpg)
M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase transkrîptazek berevajî ye ku bi vekolîna mutasyonê ya gena M-MLV ya virusa leukemiya mûşî ya Moloney û îfadeya li E.coli ve hatî wergirtin.Enzîm çalakiya RNase H ji holê radike, xwedan tolerasyona germahiyê ye, û ji bo veguheztina berevajî ya germahiya bilind maqûl e.Ji ber vê yekê, ew ji bo rakirina bandorên nebaş ên avahiya-asta bilind a RNA û faktorên ne-taybet ên li ser senteza cDNA arîkar e, û xwedan îstîqrara bilind û şiyana senteza veguheztina berevajî ye.Enzîm xwedan îstîqrara bilind û şiyana senteza veguheztina berevajî ye.
Components
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × Tampona Yekem-Strand (vebijarkî)
* 5 × Bufera Pêşîn-Strand dNTP nagire, ji kerema xwe dema ku pergala reaksiyonê amade dikin dNTP-an lê zêde bikin
Serlêdana Pêşniyar kirin
1.QRT-PCR yek gav.
2.Tespîtkirina vîrusa RNA.
Rewşa Storage
-20°C ji bo depokirina demdirêj, divê berî ku were bikar anîn baş were tevlihev kirin, ji cemidandin-germbûna pir caran dûr bisekinin.
Unit Definition
Yekîneyek 1 nmol dTTP di 10 hûrdeman de li 37°C bi karanîna poly(A)•oligo(dT) vedihewîne25wek şablon/primer.
Kontrola Kalîteyê
1.Paqijiya elektroforetîkî ya SDS-PAGE ji% 98 mezintir e.
2.Hestiyariya zêdekirinê, kontrolkirina hevîrê, aramî.
3.Çalakiya nukleazê ya eksogenous tune, endonuclease ya exogenous an tevliheviya exonuclease tune
Sazkirina Reaksiyonê ji bo Çareseriya Reaksiyona Zincîra Yekem
1.Amadekirina tevlîheviya reaksiyonê
Components | Bend |
Olîgo(dT)12-18 Primer an Random Primeryek An Gene Specific Primersb | 50 pmol |
50 pmol (20-100 pmol) | |
2 pmol | |
10 mM dNTP | 1 μL |
Şablon RNA | Tevahiya RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
dH bê RNase2O | Heta 10 μL |
Têbînî:a/b: Ji kerema xwe li gorî hewcedariyên xwe yên ceribandî cureyên cuda yên primers hilbijêrin.
2.5 deqeyan di 65°C de germ bikin û 2 deqeyan li ser cemedê zû sar bikin.
3.Hêmanên jêrîn li pergala jorîn bi tevahî 20 μL zêde bikin û bi nermî tevlihev bikin:
Components | Volume (μL) |
5 × Yekem-Strand Buffer | 4 |
Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
Inhibîtorê RNase (40 U/μL) | 1 |
dH bê RNase2O | Heta 20 μL |
4.Ji kerema xwe reaksiyonê li gorî şert û mercên jêrîn pêk bînin:
(1) Ger Random Primer were bikar anîn, divê reaksiyonê li 25℃ ji bo 10 hûrdeman, û dûv re li 50℃ ji bo 30 ~ 60 hûrdeman were kirin;
(2) Ger Oligo dT an primerên taybetî têne bikar anîn, divê reaksîyon li 50 ℃ ji bo 30 ~ 60 hûrdeman were kirin.
5.Li 95℃ 5 hûrdeman germ bikin da ku Neoscript Reverse Transcriptase neçalak bike û reaksiyonê biqedîne.
6.Berhemên veguheztina berevajî dikare rasterast di reaksiyona PCR û reaksiyona PCR-ya mîqdar a fluorescence de were bikar anîn, an ji bo demek dirêj li -20℃ were hilanîn.
PCR Reaction:
1.Amadekirina tevlîheviya reaksiyonê
Components | Lisersekinî |
10 × PCR Buffer (dNTP belaş, Mg²+ belaş) | 1× |
dNTP (10mM her dNTP) | 200 μM |
25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
Taq DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2,5 U |
Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
Şablonyek | ≤10% Çareseriya Reaksiyona Zincîra Yekem (2 μL) |
ddH2O | Heta 50 μL |
Têbînî:a: Heke pir zêde çareseriya reaksiyona zincîra yekem were zêdekirin, dibe ku reaksiyona PCR were asteng kirin.
2.Pêvajoya Reaksiyonê ya PCR
Gav | Germî | Dem | Cycles |
Pre-denaturation | 95℃ | 2-5 min | 1 |
Denaturasyon | 95℃ | 10-20 saniye | 30-40 |
Annealing | 50-60℃ | 10-30 saniye | |
Dirêjkirinî | 72℃ | 10-60 sec |
Têbînî
1.Ji bo xweşbîniya germahiya veguheztina berevajî ya di navbera 42℃~55℃ de maqûl e.
2.Ew xwedan îstîqrara çêtir e, ji bo zêdekirina veguheztina berevajî ya germahiya bilind maqûl e.Digel vê yekê, ew ji bo derbasbûna bi bandor di nav deverên pêkhatî yên tevlihev ên RNA de guncan e.Her weha, ewji bo tespîtkirina RT-PCR-ya mîqdar a fluoresansê ya yek-gavekî minasib e.
3.Bi cûrbecûr enzîmên zêdekirina PCR-ê re lihevhatinek baş e û ji bo reaksiyonên RT-PCR bi hestiyariya bilind re maqûl e.
4.Minasib ji bo reaksiyona RT-PCR ya mîqdar a yek-gavekî ya fluorescence ya bi hesasiya bilind, bi bandor rêjeya tespîtkirina hûrbûna kêm a şablonan çêtir dike.
5.Ji bo avakirina pirtûkxaneya cDNA maqûl e.