Vaccinia Virus Capping Enzyme

Enzîma vegirtina vîrusa vaccinia ji çelekek E. coli ya rekombînant ku genên enzîma vegirtinê ya Vaccinia hildigire tê.Ev enzîma yekane ji du yekîneyan (D1 û D12) pêk tê û sê çalakiyên enzîmatîk hene (RNA trifosfataz û guanylyltransferase ji hêla binyekîneya D1 ve û guanine methyltransferase ji hêla yekîneya D12 ve).Vîrûsa Vaccinia Capping Enzyme ji bo katalîzasyona avakirina strukturê kapê bandorker e, ku dikare bi taybetî strukturê kapika 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) bi dawiya 5' ya RNA ve girêbide.Avahiya kapê (Cap 0) di stabîlîzasyona mRNA, veguheztin û wergerandina eukaryotan de rolek girîng dilîze.Girtina RNA bi reaksiyona enzîmatîk rêbazek bi bandor û hêsan e ku dikare aramî û wergerandina RNA ji bo veguheztina in vitro, veguheztin û mîkroînjeksiyonê bi girîngî baştir bike.

Components

Enzîma girtina Vaccinia Virus (10 U/μL)

10× Tampon girtina

Şertên hilanînê

-25～- 15℃ ji bo hilanînê （ Ji çerxên cemidî-germkirinê yên dubare dûr bixin）

Storage tampon

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol.

Unit Definition

Yekînek ji enzîma Capping Virusa Vaccinia wekî mîqdara enzîma ku ji bo 10pmol GTP di nav 1 saetê de di 37°C de di nav 80nt transkrîptê de ye tê pênase kirin.

Kontrola Kalîteyê

Exonuclease:10U ji enzîma vegirtinê ya virusa Vaccinia bi 1μg λ-Hind III DNA di 37 ℃ de ji bo 16 saetan dişewitîne, wekî ku ji hêla elektroforez gêla agarose ve hatî destnîşan kirin, hilweşînek dernakeve.

Endonukleaz:10U ji enzîma vegirtinê ya virusa Vaccinia bi 1μg λDNA li 37℃ ji bo 16 saetan, wekî ku ji hêla elektroforezê gêla agarose ve hatî destnîşan kirin, hilweşînek dernakeve.

Nickase:10U ji Vaccinia Virus Capping Enzyme bi 1 μg pBR322 di 37 ℃ de ji bo 16 demjimêran, wekî ku ji hêla elektroforez gêla agarose ve hatî destnîşankirin, hilweşînek dernakeve.

RNase:10U ji Vaccinia Virus Capping Enzyme bi 1,6μg MS2 RNA ji bo 4 saetan di 37℃ de, wekî ku ji hêla elektroforezê gêla agarose ve hatî destnîşankirin, hilweşînek dernakeve.

1.coli DNA:10U ji virusa Vaccinia Capping Enzîma ji bo hebûna ADNya genomî ya E. coli bi karanîna TaqMan qPCR bi primerên taybetî yên ji bo cihê E. coli 16S rRNA tê kontrol kirin.Tevliheviya ADN-ya genomî ya E. coli ≤1 genoma E. coli ye.

2.Bakterî Endotoksîn: Testa LAL, li gorî çapa Pharmacopoeia IV 2020 ya Chineseînî, rêbaza ceribandina sînorê gel, qaîdeya gelemperî (1143).Divê naveroka endotoksîna bakterî ≤10 EU/mg be.

Pergal û şertên reaksiyonê

1. Protokola Kepkirinê (Hejmara reaksiyonê: 20 μL)

Ev prosedur ji bo reaksiyona girtina 10μg RNA (≥100 nt) tê sepandin û ew dikare li gorî daxwazên ceribandinê were mezin kirin.

I) 10μg RNA û H2O ya bê Nukleaz di lûleya mîkrofûjê ya 1,5 ml de bi cildeke dawîn a 15,0 μL bigihînin hev.* 10× Tampon girtina: 0,5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8,0)

2) 5 hûrdeman li 65℃ germ bikin û dûv re jî 5 hûrdeman serşokê cemedê.

3) Bi rêza diyarkirî pêkhateyên jêrîn lê zêde bikin

* 10× Tampon girtina: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8,0)

4) 30 hûrdeman di 37°C de înkub bikin, ARN naha hatiye girtin û ji bo sepanên jêrîn amade ye.

2. 5 'termînalê reaksiyona etîketkirinê (hejmara reaksiyonê: 20 μL)

Ev protokol ji bo nîşankirina RNAya ku 5' trîfosfat dihewîne hatiye çêkirin û ew dikare li gorî daxwazê ​​were mezin kirin.Karbidestiya tevlêbûna labelê dê ji hêla rêjeya molar a RNA: GTP, û her weha naveroka GTP-ê di nimûneyên RNA de bandor bibe.

1) Mîqdarek guncaw a RNA û H2O-ya bê Nukleaz di lûleya mîkrofûjê ya 1,5 ml de bigihîje volga dawî ya 14,0 µL.

2) 5 hûrdeman li 65℃ germ bikin û dûv re jî 5 hûrdeman serşokê cemedê.

3) Bi rêza diyarkirî pêkhateyên jêrîn lê zêde bikin.

** GTP MIX GTP û hejmarek piçûk nîşankeran vedibêje.Ji bo giraniya GTP, binihêrinji bo Têbînî 3.

4) 30 hûrdeman li 37°C înkub bikin, dawiya RNA 5' naha hatiye nîşankirin û ji bo jêrzemînê amade ye.

Applications

1. Beriya vekolînên wergerandinê/wergera in vitro mRNA girtin

2. Nîşankirina 5' dawiya mRNA

Têbînî li ser bikaranîna

1.Germkirina çareseriya RNA ya beriya inkubasyonê bi Vaccinia Capping Enzyme, avahiya duyemîn a li ser dawiya 5'ya transkrîptê radike.Demjimêra 60 hûrdeman dirêj bikin ji bo transkrîpsiyonên bi 5 'dawiyên pir avakirî yên naskirî.

2. ARN-ya ku ji bo reaksiyonên sergirtî tê bikar anîn, divê berî ku were bikar anîn were paqij kirin û di ava bê nukleaz de were sekinandin.Divê EDTA nebe û çareserî bê xwê be.

3. Ji bo etîketkirina dawiya 5´, giştiya GTP-ê divê di reaksiyonê de 1-3 qat ji berhevoka molarê ya mRNA be.

4. Hêjmara pergala reaksiyonê li gorî rastîn dikare zêde bibe an kêm bibe.