mRNA Cap2'-O-Methyltransferase
mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase ji çelekek E. coli ya rekombînant a ku gena vaccinia mRNA Cap 2 '-O-Methyltransferase hildigire, derketiye.Ev enzîm komek methyl li pozîsyona 2´-O ya nukleotîda yekem li tenişta avahiya kapê ya li dawiya 5´ya ARNyê zêde dike. Enzîm S-adenosylmethionine (SAM) wekî donatorek metîlî bikar tîne da ku RNA-ya sergirtî (kap -0) di encamê de avahiyek kap- 1.
Struktura Cap1 dikare karîgeriya wergerê zêde bike, di ceribandinên veguheztinê û mîkroînjeksiyonê de vegotina mRNAyê baştir bike. Ev enzîm bi taybetî RNA bi kapek m7GpppN wekî substrat hewce dike.Ew nikare RNA bi pN, ppN, pppN an GpppN di dawiya 5´ de bikar bîne.ARN-ya girtî dikare bi transkrîpsiyona in vitro bi karanîna analoga kapak an jî bi vegirtina enzîmatîk bi karanîna Enzîma Vaccinia Capping were amadekirin.
Components
mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)
10× Capping Reaction Tampon
Embarkirinî
-25 ～- 15 ℃ ji bo hilanînê （ Ji çerxên cemidî-germkirinê yên dubare dûr bixin）
Storage tampon
20 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol.
Unit pênase
Yekînek wekî mîqdara enzîma ku ji bo methylatekirina 10 pmoles ji 80 nt transkripta ARN-ya sergirtî di 1 saetê de di 37°C de hewce dike tê pênase kirin.
Assayên kontrolkirina kalîteyê
Exonuclease: 50U mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase bi 1μg λ-Hind III di 37 ℃ de ADNyê dişewitîne ji bo 16 saetan, wekî ku bi elektroforez gêla agarose ve hatî destnîşan kirin, hilweşînek dernakeve.
Endonukleaz: 50 U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase bi 1 μg λDNA li 37℃ ji bo 16 demjimêran, wekî ku ji hêla elektroforez gêla agarose ve hatî destnîşankirin, hilweşînek dernakeve.
Nickase: 50U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase bi 1μg pBR322 li 37 ℃ ji bo 16 demjimêran, wekî ku ji hêla elektroforezê gêla agarose ve hatî destnîşankirin, hilweşînek dernakeve.
RNase: 50U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase bi 1.6μg MS2 RNA ji bo 4 saetan di 37℃ de, wekî ku ji hêla elektroforezê gêla agarose ve hatî destnîşankirin, hilweşînek dernakeve.
E. coli DNA: 50U mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase ji bo hebûnaE. coli ADN-ya genomîk TaqMan qPCR bi primerên taybetî yên ji bo vê bikar tîneE. coli Cihê 16S rRNA.EwE. coli qirêjbûna DNA ya genomî =1 eE. coli genom.
Bakterî Endotoxin: Testa LAL, li gorî çapa Pharmacopoeia IV 2020 ya Chineseînî, rêbaza ceribandina sînorê gel, qaîdeya gelemperî (1143).Naveroka endotoksîna bakterî divê =10 EU/mg be.
Pergal û şertên reaksiyonê
1. Di lûleya mîkrofûjê ya 1,5 mL de mîqdarek guncav a ARN-ya Girtî û H2O ya bê RNase bi hev re bigihînin volga dawî ya 16,0 µL.
2. 5 deqeyan di germahiya 65℃ de germ bikin.
3. Bi rêza diyarkirî pêkhateyên jêrîn lê zêde bikin (ji bo metilasyona ARN-ya Kapkirî
kêmtir ji 10
| Perçe | Bend |
| ARNya sergirtî ya denaturated | 16 μL |
| 10X Tampona Reaksiyonê Girtî * | 2 μL |
| SAM (4 mM) | 1 μL |
| mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50 U/μL) | 1 μL |
| ddH2O | Heta 20 μL |
* 10× Tampona Reaksiyona Kepkirinê: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.
4. Li 37 ℃ 1 saetê înkub bikin (ji bo perçeya armancê ji 200 nt kêmtir 2 saet inkubasyon tê pêşniyar kirin).
Applications
Ji bo baştirkirina îfadeya mRNA di dema ceribandinên mîkroînjeksiyonê û veguheztinê de.
Têbînî li ser bikaranîna
1. Berî reaksiyonê, divê ARN were paqijkirin û di ava bê nukleaz de were helandin, divê hemî çareserî EDTA û îyonan negirin.
2. Tê pêşniyar kirin ku RNA-ya nimûneyê di 65℃ de 5 hûrdem berî reaksiyonê germ bikin da ku avahiya duyemîn a li ser dawiya 5'ya transkrîptê were rakirin.Ew dikare ji bo strukturên 5 '-termînal ên tevlihev heya 10 hûrdem were dirêj kirin.
