KITÊN ELISA ya ARN-ya dubendî (dsRNA).

Ev kît bi pergala biotin-Streptavidin ve bi Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ve girêdayî ye, ji bo pîvandina mîqdar a dsRNA ya bi dirêjahiya 60 cotên bingehîn (bp), bêyî rêzê.Plateyek berê bi antî-dsRNA antîpoş hatiye pêçan.dsRNA ya ku di nimûneyê de heye tê zêdekirin û bi antîbodên ku li ser bîran hatine pêçandin ve girêdide.Û dûv re antî-dsRNA ya biotinylated tê zêdekirin û di nimûneyê de bi dsRNA ve girêdide.Piştî şuştinê, HRP-Streptavidin tê zêdekirin û bi antî-dsRNA ya Biotinylated ve girêdide.Piştî înkubasyonê, HRP-Streptavidin negirêdayî tê şûştin.Dûv re çareseriya substratê TMB tê zêdekirin û ji hêla HRP ve tê katalîz kirin da ku hilberek rengê şîn çêbike ku piştî lê zêdekirina çareseriya rawestandina asîdî zer diguhere.Tîrêjiya zer bi rêjeya armancê ya dsRNA ya ku di plakê de hatî girtin re têkildar e.Veguheztin di 450 nm de tê pîvandin.

Bikaranînî

Ev kît ji bo pîvandina mîqdar a dsRNA mayî ye.

pêkhateyên Kit

Storage û Stability

1. Ji bo kîtê nekarandî: Tevahiya kît dikare di 2~8℃ de di heyama rafê de were hilanîn.Ji bo îstîqrara hilanînê divê ronahiya bihêz were dûr xistin.

2. Ji bo kîta bi kar anîn: Dema ku mîkroplate vebe, ji kerema xwe bîrên ku nehatine bikar anîn bi pêlava plakê veşêrin û vegerin poça foilê ya ku pakêta desiccant tê de ye, tûrika foilê bi zip-mohr bike û piştî karanîna zûtirîn dem vegere 2~8℃.Pêdivî ye ku reagentên din piştî karanîna zûtirîn li 2-8 ℃ vegerînin.

Materyalên Pêwîstî Lê Nayên Pêşniyar kirin

1. Xwendevana mîkroplate ya bi parzûna 450±10nm (çêtir e ku meriv di dirêjahiya pêlê de 450 û 650 nm tespît bike).

2. Microplate shaker.

3. Tîpên bê-RNase û lûleyên santrîfujê.

Operasyona Flowchart

Berî ku Hûn Dest pê bikin

1. Berî ku bikar bînin hemî pêkhateyên kîtê û nimûneyan bînin germahiya odeyê (18-25℃).Heke kît dê di yek carê de neyê bikar anîn, ji kerema xwe tenê ji bo ceribandina heyî şirît û reagentan derxînin, û şirîtên mayî û reagentên di rewşa pêwîst de bihêlin.

2. Tampon şuştinê: 40mL tampon şuştinê ya 20× ya konsantrekirî bi 760 ml ava deionîzekirî an distîlkirî re bişewitînin da ku 800 ml tampon şuştinê 1× amade bikin.

3. Standard: berî ku bikar bînin çareseriya stokê bi kurtî bizivirînin an santrîfuj bikin.Pîvana çar standardên peydakirî 5ng / μL ye.Ji bo standardên UTP û pUTP dsRNA, ji kerema xwe çareseriya stokê bi 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0pg/μL bi tampon STE re xêz bike da ku kêşeya standard bikişîne.Ji bo standardên dsRNA yên N1-Me-pUTP, ji kerema xwe çareseriya stokê bi 2,1,0,5,0,25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL bi tampon STE-yê veqetînin da ku kêşeya standard bikişîne.Ji bo standarda dsRNA ya 5-OMe-UTP, ji kerema xwe çareseriya stûnê bi 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL bi tampon STE-yê veqetînin da ku kêşeya standard bikişîne.Em pêşniyar dikin ku standard dikarin wekî nexşeyên jêrîn werin rijandin:

4. Antîpoşa tespîtkirina biotinylated û çareseriya xebatê ya HRP-streptavidin: Berî bikar anînê bi kurtî spî an santrîfujê bikin çareseriya stokê.Wan bi tamponê dilopkirinê heya konsantasyona xebatê hûr bikin.

5. Bindewleta TMB: Doza pêwîst a çareseriyê bi şîretên sterilîzekirî aspire bikin û çareseriya bermayî careke din neavêjin nav şûşê.Substrata TMB ji ronahiyê re hestiyar e, substrata TMB-ê ji bo demek dirêj ve nexe ber ronahiyê.

Bikaranîna protokolê

1. Hejmara tîrêjên ku ji bo ceribandinê hewce ne diyar bikin.Ji bo karanînê şirîtan têxin çarçeweyan.Rêzikên plakaya mayî yên ku di vê ceribandinê de nehatine bikar anîn divê di çenteyê de bi desiccant ji nû ve werin pakij kirin.Ji bo depokirina sarincokê tûrikê hişk bigrin.

2. 100μL her yek ji dilûkên standard, vala û nimûneyan li bîrên guncaw zêde bikin.Bi sealer plakaya veşêrin.1 saetan li germahiya odeyê bi hejandina bi 500 rpm de vedihewînin.Nimûne divê bi tamponê STE-ê ji bo pîvandina rast were rijandin.

3. Qonaxa şuştinê: Çareseriyê aspire bikin û bi 250 μL tampon şuştinê li her bîrekê bişon û bihêlin 30 saniyan bisekine.Tampona şuştinê bi xistina plakê li ser kaxizek vegirtinê bi tevahî bavêjin.Bi tevahî 4 caran şuştin.

4. 100μL çareseriya xebatê ya antîpîdê ya biotinylated bixin nav her bîrekê.Bi sealer plakaya veşêrin.1 saetan li germahiya odeyê bi hejandina bi 500 rpm de vedişêrin.

5. Pêngava şuştinê dubare bikin.

6. 100μL çareseriya xebatê ya HRP-streptavidin di her bîrê de zêde bikin.Bi sealer plakaya veşêrin.30 hûrdeman li germahiya odeyê bi 500 rpm de bihejînin.

7. Pêngava şuştinê dîsa dubare bikin.

8. 100μL çareseriya substratê TMB li her bîrekê zêde bikin.Bi sealer plakaya veşêrin.30 hûrdem li RT ji ronahiyê biparêzin.Bi lêzêdekirina çareseriya substratê şîn dibe.

9. 50μL çareseriya rawestanê têxin nava her bîrekê.Bi lêzêdekirina çareseriya rawestanê dê şilek zer bibe.Dûv re xwendevana mîkroplate bimeşînin û tavilê li 450nm pîvandinê bikin.

Hesabkirina Encaman

1. Ji bo her standard, kontrol, û nimûneyên xwendinên ducar navîn bikin û tîrêjiya optîkî ya standard sifir ya navîn jê bikin.Kûçek standard bi vegirtinê li ser teşeya vertîkal (Y) û bi giraniya dsRNA li ser horizontî (x) ava bikin.

2. Tê pêşnîyar kirin ku hesabkirin bi nermalava guncan a komputer-based wekî pisporê kevçîyê 1.3 an ELISA Calc di modela 5 an 4 parametreya ne-xêzik de were kirin.

Birêvebirinî

1. Hesasiyet:

sînorê jêrîn ê tespîtkirinê: ≤ 0,001 pg/μL (ji bo UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (ji bo 5-OMe-UTP-dsRNA).

sînorê jêrîn ê hejmartinê: 0,0156 pg/μL (ji bo UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (ji bo N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (ji bo 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Rastbûn: CV ya Intra-Assay ≤10%, CV ya Inter-Assay ≤10%

3. Rakirin:80%~120%

4. Xêzîtî: 0.0156-0.5 pg/μL (boUTP-, pUTP-dsRNA) 0.0312-1 pg/μL (ji bo N1-Me-pUTP dsRNA), 0.0625-1 pg/μL (ji bo 5-OMe-UTP-dsRNA).

Considerations

1. Germahiya reaksiyona TMB û dem krîtîk e, ji kerema xwe wan li gorî rêwerzan bi hişkî kontrol bikin.

2. Ji bo bidestxistina dubarebûn û hesasiyeteke baş a ceribandinê, şuştina birêkûpêk a plakan ji bo rakirina reagentên zêde yên ku reaksîyon çênebûne pêdivî ye.

3. Pêdivî ye ku hemî reagent berî ku werin bikar anîn bi baldarî werin tevlihev kirin û di dema zêdekirina nimûne an reagentan de ji qurmiyan dûr bikevin.

4. Ger di tampona şuştinê ya konsantrekirî (20x) de krîstal çêbûne, heya 37℃ germ bikin û bi nermî tevlihev bikin heya ku krîstal bi tevahî belav bibin.

5. Ji ceribandina nimûneyên ku Sodyum Azide (NaN3) dihewîne xwe dûr bixin, ji ber ku ew dikare çalakiya HRP hilweşîne û di encamê de kêmjimara dsRNA kêm bibe.

6. Di dema ceribandinê de ji qirêjiya RNase dûr bixin.

7. Standard/nimûne, antîpîdên tespîtkirinê û SA-HRP jî dikarin li RT bêyî hejandin werin meşandin, lê dibe ku ev yek bibe sedema kêmbûna hestiyariya tespîtê yek carî.Ji bo vê rewşê, em pêşniyar dikin ku standardên UTP û pUTP dsRNA ji 2pg/μL werin rijandin, standardên N1-Me-pUTP dsRNA ji 4pg/μL bêne rijandin û standarda dsRNA 5-OMe-UTP divê ji 8pg/μL were rijandin.Wekî din, çareseriya xebatê ya HRP-streptavidin 60 hûrdeman li germahiya odeyê înkuba bikin.Şirika flaskek bikar neynin, ji ber ku şikilê flask dibe ku encamek nerast bide.

Encama tîpîk

1. Daneyên kelek standard

2. Hesabkirina kemera standard

3. Rêjeya tespîtkirina xêzikê: 0.0312- 1pg/μL